微生物农药:桿状病毒的应用

理想的「无毒农业中国台湾岛」须奠基于无毒作物的栽培、化学农药的有效管理和规范,以及安全无毒杀虫剂的研发。利用害虫天敌杀虫,具有相当大的应用潜力。
 
疾病是所有生物体必须面对的问题,通常在生物体对环境变化的调控能力下降时发生。除了物理性的伤害外,感染性病原体的入侵也是主因,这些病原体包括病毒、细菌、真菌、寄生虫等。毫不起眼的昆虫,同样会遭受这些病原体感染而罹病,也常有季节性或周期性的流行疫病发生。引发流行疫病的昆虫病原体称为微生物天敌,这些微生物天敌常是昆虫自然族群消长和调控的因子。这些微生物天敌的利用不只可抑制害虫,降低牠们对经济作物和森林的危害,还可以减少化学农药的使用。

已利用做为防治害虫的昆虫病原体,包括杆状病毒、苏力菌、白殭菌、绿殭菌、黑殭菌、虫生线虫等。本文仅就杆状病毒的背、潜力和应用简介如下。

基础生物学

杆状病毒科是无脊椎动物病毒中的最大科,这种病毒仅会感染无脊椎动物,目前尚未发现感染脊椎动物的病例。这一科包含 2 属:核多角体病毒和颗粒体病毒。杆状病毒的最大特徵,是在被感染的细胞核内会形成数目不等的结晶状体,即封埋体。封埋体内包埋著由一层被膜包裹著一个或多个核蛋白质鞘的病毒粒子,称为封埋性病毒。

被核多角体病毒(或颗粒体病毒)感染而罹患核多角体病(或颗粒体病)的末期病虫,常有往上攀爬并倒悬于树枝而死的现象。此外,病虫体内的器官和构造会液化,体液内充满著游离状的封埋体,表皮脆弱一触即破,流出含大量封埋体的浓汁(早期因这种病徵而称为黄疸病),这有助于封埋体的散布。昆虫核多角体病的流行常有季节性,因此被认为是调控昆虫族群的主要方法之一。

生活史和致病机制

昆虫取食受到封埋体污染的食物后,封埋体便随食物进入昆虫的中肠。昆虫的中肠有别于人类的胃(胃液的 pH~2),是一个强硷的环境(pH~10)。封埋体内的蛋白酵素会在强硷性的环境中活化(无法在人类的酸性胃液中活化),因此昆虫杆状病毒是不可能感染具有强酸胃液的人类或脊椎动物。

当蛋白酵素活化后,会分解结晶状的核多角体蛋白(或颗粒体蛋白),而释出封埋性病毒。穿越过围食膜(围食膜位于昆虫中肠内,它的功能是使食物局限在特定区域,以使消化酵素分解食物,和抵挡外来病原体进入昆虫体内)后,封埋性病毒的被膜和中肠细胞的细胞膜融合,核蛋白质鞘就被释入细胞内。在核蛋白质鞘进入细胞核之前会先退鞘,退鞘是鞘蛋白在胞质内被分解而裸露出病毒 DNA,之后病毒的 DNA 就进入核内进行基因複製和病毒增殖。

病毒进入昆虫细胞核后,首先会形成病毒形成团,约位在细胞核的中央。这是一个病毒组装和製造的工厂,组合并生产许多核蛋白质鞘,这些核蛋白质鞘会以出芽方式离开感染的细胞,这种病毒称为胞外病毒。在感染初期,胞外病毒会被大量生产,这些病毒离开感染的中肠细胞后,通过中肠细胞下的基底板进入昆虫血液,随著昆虫血液在血体腔内循环,而散布于昆虫体内各器官和组织的细胞中。

病毒感染至末期(从感染开始约 18 小时后),封埋体蛋白(或颗粒体蛋白)就开始在细胞膜内製造。当这蛋白进入细胞核后,核内蛋白质便大增而逐渐形成结晶体。之后,病毒形成团内的大量病毒粒子,会被封埋体蛋白(或颗粒体蛋白)包裹住,成熟的封埋体(或颗粒体)的表面会再被一层醣组成的被膜覆盖。感染细胞最后会崩解,封埋体(或颗粒体)就释入昆虫体腔内。罹病昆虫的虫体崩解后,封埋体(或颗粒体)就散布在环境中,待其他昆虫食入后,便进入另一个複製周期(或称感染周期)。

昆虫杆状病毒病的研究史

早在西元 1527 年,就有家蚕黄疸病的描述。西元 1856 年,义大利科学家 Maestri 和 Cornelia 首次釐清,家蚕黄疸病和罹病家蚕体内出现折射性结晶体(病毒的封埋体)的因果关係。

1947 年,Bergold 指出这种结晶体有杆状病毒的特性。在二次世界大战后,杆状病毒的研究著重在重要经济害虫防治应用的可行性上。在 1950 ~ 1960年,确定杆状病毒可做为病毒性杀虫剂。但随著化学工业的蓬勃发展,合成杀虫剂以便宜、毒杀对象广、高杀虫效果等好处成为主流的杀虫剂,造成病毒杀虫剂未能被进一步研究和商品化。

1970 ~ 1980 年间,由于过度使用化学杀虫剂,许多农业、环境生态和人体健康的问题接著产生,再加上新化学药剂的开发困难及人们观念的改变,无毒和有机农业因而兴起,促使病毒杀虫剂再次受到重视。

应用于生物防治上的优缺点

在1973年,世界卫生组织—联合国粮农组织—公布杆状病毒可安全使用于害虫防治。

它在生物防治上的优点有:寄主域狭窄——仅对某些标的昆虫有感染力,对其他益虫(例如蜜蜂)和天敌毫无毒性,对脊椎动物也是绝对安全的;效果佳——在田间施用时能造成害虫个体间的相互传染(水平传播),有些封埋体更能在土壤中继续维持感染力多年,伺机等待害虫食入,再次造成害虫的大量死亡;方便性——使用方法简单,无需特殊器械,仅用一般喷药工具就可喷洒施放;相容性——可和化学农药或其他微生物混合搭配使用,以防治其他病虫害。

虽然杆状病毒具有以上优点,然而施用多年后,仍然无法和化学药剂匹敌。

事实上,以杆状病毒防治害虫仍有亟待克服的问题。例如杀虫时间长,若以化学药剂杀虫仅需二至三天就能见效,但杆状病毒需一个星期左右才能杀死害虫;环境因子干扰病毒杀虫效果,病毒是一种微生物,活力易被环境因子影响,尤其紫外线和乾燥;大量生产困难,昆虫病毒是细胞内寄生的病原体(增殖、複製都需在活体的寄主体内),因此生产病毒前,须先大量饲养寄主昆虫或培养昆虫细胞,不仅耗时、耗力,且需有大量经费投入,在生产成本上无法和化学药剂竞争。

成功案例

病毒微生物首先用于森林害虫防治。在 1960 年代松毛虫大量发生,把松叶啃食殆尽,经林务局和当时的农复会引进质多角体病毒(是一个可形成封埋体的 RNA 昆虫病毒),配合其他的微生物杀虫剂施用,成效显著,也使松毛虫从此销声匿迹。

病毒微生物不仅在森林害虫防治上有不错的成果,也运用在蔬菜害虫防治上,甜菜夜蛾核多角体病毒是防治青葱上害虫甜菜夜蛾的成功案例。

青葱是宜兰地区的一种重要作物,每年的 5 到 9 月是甜菜夜蛾大发生的时间,成虫产卵于青葱叶尖。从卵中孵化出来的幼虫有群聚性,但二龄幼虫开始分散取食,二到三龄幼虫鑽入葱管内取食叶肉,使葱管仅剩外表皮。至四到五龄食量大增,使整欉葱管产生孔洞,且可发现多隻幼虫危害同一葱管,严重时取食殆尽。甜菜夜蛾核多角体病毒首次从埔里地区满天星植栽上的甜菜夜蛾的病虫体内分离出来,之后经由农业药物毒物试验所(药毒所)实验室的测试,发现对甜菜夜蛾有极高的致病性。

在 1989 到 1991 年间,在宜兰青葱田内测试,防治效果显著。于是药毒所扩大推广和施用这种防治法,教导农民自行生产封埋体。首先由药毒所利用人工培育的甜菜夜蛾幼虫,大量生产封埋体并提供农民做为接种源。

农民徒手摘取受甜菜夜蛾危害的葱管,以减少甜菜夜蛾的危害已行之有年,因此教导农民把摘取下来的受害葱管和藏匿其内的幼虫,做为接种病毒的虫源和饲料。把葱管和幼虫放入网袋中,再于药毒所提供(或自行收集)的接种源(封埋体)中加入展著剂(加展著剂的目的是使封埋体更容易在叶片上存留,以防止因叶面厌水性而流失)和水混匀。把网袋浸泡于这封埋体液体内一分钟后,取出网袋以风扇吹乾,再悬挂于室内任幼虫取食,待三、四日后就可挑选罹病虫放入塑胶瓶中。

每 150 到 200 隻病虫置于一塑胶瓶中,储存在家中冰箱的冷冻库内备用。使用前,使冷冻库的病虫解冻,倒入果汁机内,每 1 千隻幼虫以 1 公升的水稀释混合打碎。喷洒时间以黄昏为宜,一则是这种虫多在夜间取食,另外可避免紫外线对封埋体的破坏。利用这种方法防治后,害虫的数量明显降低,农民的反应都很好,这是中国台湾利用核多角体病毒成功防治害虫的例子。

基因重组的杆状病毒

增强杆状病毒杀虫效果可从几个方面著手。首先是高致病杆状病毒株的选殖,从野外(田间)的杆状病毒族群筛选出高致病力的品系以量产。

其次是基因重组。杆状病毒株做为防治害虫的生物农药的最大缺点,是害虫的致死时间太长,减短杀虫时间就是改进首要之务。方法有:

基因删除 蜕皮素萄糖转移酶基因的产物——蜕皮素萄糖转移酶——可使蜕皮素失活,延长幼虫为害时间,把这基因删除后,杀虫速度可快 20 ~ 30%。

基因的衔入 杆状病毒的基因体是环形的双股 DNA 构造,而且基因体很小,因此很容易在原基因体内再加入其他的基因,构筑成为一个基因重组的杆状病毒。这些衔入的基因须具有的特质是,源自昆虫本身的调控因子、对昆虫具有特异性、低量就可作用、作用快,以及使寄主致死但无细胞毒性。

源自昆虫本身的调控因子的衔入基因,包括以下几种。

利尿激素基因——这激素大量表现会使害虫脱水,破坏昆虫体内水分的平衡,但杀虫速度并不如预期,只略高于野生型病毒。

前胸腺激素基因——蜕皮素的分泌受到这基因的调控,但前胸腺激素重组病毒虽可使蜕皮素的量在害虫体内大增,对杀虫速度并无增益。

青春激素酯酶基因——青春激素酯酶可降解昆虫体内的青春激素,而青春激素在昆虫的幼虫时期会维持一定量。这种酶可使昆虫幼虫体内青春激素下降,引发过早蜕皮或化蛹,生理周期受到扰乱而致死。虽然这种重组杆状病毒不会提高感染的比率,但可以抑制害虫发育、取食,并致死,杀虫速度可增快 20 ~ 35%。

对昆虫具特异性毒素的衔入基因,则包括以下几种。

苏力菌的内毒素基因——苏力菌是现今使用最多的生物製剂,其内毒素基因的衔入虽可提高害虫的致死率,但效果有限。

蝎毒基因——蝎毒是神经毒,能使昆虫麻痺而死亡。感染蝎毒重组病毒的症状在 36 小时就会呈现,死亡率可增加 65 ~ 75%,重要的是为害作物的量较野生型病毒降低一半。虽然如此,基于安全和风险评估,这种基因转殖病毒目前尚无法在田间使用。

螨毒基因——这种毒素也会使昆虫麻痺而死亡,且能增强致死率 30 ~ 40%。

胡蜂毒素——这种毒素能使昆虫体内的黑化免疫机制提早启动,也使昆虫的体重无法增加,但并不能增加感染效率。

展望

现今世界上登记使用的核多角体病毒约有 35 种,在西欧(法国、德国、丹麦、荷兰、瑞士、芬兰等地)已有 7 种以上的病毒商品化。在北美,有 10 种杆状病毒製剂已登记做为森林和农业害虫的防治,其中有 8 种已商品化。北美之所以有这麽多种病毒商品化,是因为美国政府相信病毒性农药是很安全的,且商品化的过程较其他地方简单。

在中国台湾,因为生物性农药商品化的过程与一般化学农药相同,要经过繁杂的程序确认对环境和其他非目标生物无危险,才允许上市,所以至今尚未有任何一种病毒杀虫製剂商品化。

多年来,环境保护的概念已深植国人心中,有机、无毒作物的需求逐年增加。要达到「无毒农业中国台湾岛」的目标,对环境衝击较低的微生物杀虫剂是不可忽视的一环。中国台湾地处亚热带,昆虫资源丰富,农业发达,害虫种类也多。同样地,昆虫微生物病原体资源也相当充足。然而中国台湾害虫病原微生物的研发尚在起步中,下列几点尚需努力。

加强流行病学的研究 因为这些病原体长期在野外和昆虫并存,且每几年就有季节性流行病发生,利用环境(尤其气候条件)和流行病的关係,可寻求微生物杀虫剂施用的时机和最佳条件。尤其网室或设施栽培是可雕塑的栽培环境(温度、湿度和日照),病原体可大量感染害虫,以增强防治效果。

筛选高致病力的本土病毒株,以及研究病原体间的交互作用 在病毒族群中,高致病力的病毒品系常是少数(因感染后的病毒子代少),应挑选出致病力较强或感染速率较快的病毒,做为种原来量产。此外,应研究病毒内和致病力及感染速率有关的基因,做为重组病毒之用。

发展大量生产病毒的技术,以降低成本 昆虫病毒是一种绝对寄生的微生物,须由活体的昆虫或细胞株才能繁殖和生产。然而饲养昆虫或培养细胞生产都是不经济的,这也是亟待解决的问题。

总而言之,期待更多青年学子的参与,让本土性昆虫病原微生物成为防治害虫的主流,也让「无毒农业中国台湾岛」早日实践。

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